Principiile de fluorescenţă stinsă (FS)

Fluorescenţa stinsă (FS), cunoscută şi sub denumirea de stingere a fluorescenţei, este un proces fotofizic fundamental care îndeplineşte un rol esenţial în spectroscopia modernă, tehnologia de măsurare şi analiza moleculară. Aceasta a devenit un instrument indispensabil pentru măsurarea în timp real a concentraţiei de oxigen în procesarea gazelor naturale, bioprocesare, monitorizarea mediului şi diagnosticarea medicală. Atractivitatea sa constă în caracteristicile de precizie, selectivitate şi stabilitate – obţinute fără piese mobile, consumabile chimice sau sensibilităţi încrucişate specifice modelelor de senzori mai vechi.

Acest articol prezintă fundamentele fizice ale fluorescenţei stinse, metodele de detecţie şi modalităţile practice de aplicare; de asemenea, face o comparaţie între această tehnică şi alte abordări optice şi electrochimice utilizate pentru măsurarea gazelor.

Când o moleculă absoarbe energia luminii, aceasta trece într-o stare de energie electronică superioară – un proces cunoscut sub denumirea de excitaţie. Pe măsură ce revine la starea iniţială, molecula eliberează o parte din energia absorbită sub formă de lumină vizibilă sau aproape vizibilă. Această lumină reemisă se numeşte fluorescenţă.

Fluorescenţa apare doar în cazul moleculelor cu structuri electronice specifice, de obicei coloranţi organici sau complecşi ai metalelor de tranziţie. Lumina emisă are de obicei o lungime de undă mai mare (energie mai mică) decât lumina absorbită, din cauza pierderilor interne de energie în timpul relaxării. Diferenţa dintre lungimile de undă ale luminii fluorescente absorbite şi cele emise este cunoscută cu denumirea de deplasare Stokes, un concept esenţial pentru detecţia bazată pe fluorescenţă.

Fluorescenţa stinsă apare atunci când un factor determină o modificare a emiterii de lumină de către molecula fluorescentă după excitaţie. „Stingătorul” – de obicei o altă moleculă – interacţionează cu starea excitată a fluoroforului, permiţând disiparea energiei pe căi neradiative (prin coliziuni sau transfer de energie), în locul emiterii unui foton.

Există mai multe mecanisme de stingere, printre care:

• Stingerea dinamică (colizională): energia este transferată către stingător în timpul coliziunilor moleculare în starea de excitaţie.
• Stingerea statică: se formează un complex nefluorescent între fluorofor şi stingător înainte de excitaţie.
• Transferul de energie şi transferul de electroni: energia sau electronii sunt schimbaţi între specii, reducând randamentul fluorescenţei.

În multe aplicaţii industriale de detecţie, oxigenul (O₂) serveşte ca stingător. Deoarece oxigenul dezactivează eficient stările de excitaţie ale anumitor coloranţi, modificările intensităţii sau duratei de viaţă a fluorescenţei pot fi corelate direct cu concentraţia de oxigen din mediul înconjurător.

Relaţia cantitativă dintre fluorescenţa stinsă şi concentraţia stingătorului este exprimată prin ecuaţia Stern-Volmer:

I₀ / I = 1 + K_SV[Q]

Sau, în mod echivalent, folosind durata de viaţă a fluorescenţei:

τ₀ / τ = 1 + K_SV[Q]

Unde:

• I₀ şi τ₀ sunt intensitatea fluorescenţei şi durata de viaţă fără stingător.
• I şi τ sunt valorile corespunzătoare în prezenţa stingătorului.
• K_SV este constanta de stingere Stern-Volmer.
• [Q] este concentraţia stingătorului.

Liniaritatea acestei relaţii constituie baza pentru detecţia cantitativă. Prin monitorizarea modificării intensităţii fluorescenţei sau a duratei de viaţă, concentraţia stingătorului, cum ar fi oxigenul dizolvat sau gazos, poate fi determinată cu precizie.

Senzorii optici de oxigen se bazează pe principiul potrivit căruia moleculele de oxigen pot „stinge” fluorescenţa unui colorant excitat. De regulă, măsurarea presupune următorii paşi:

1. Excitaţie: o sursă de lumină, adesea un LED albastru (≈470 nm), iluminează un colorant fluorescent imobilizat într-o matrice permeabilă la oxigen.
2. Emisie: în absenţa oxigenului, colorantul emite fluorescenţă de culoare roşu aprins sau aproape infraroşie.
3. Stingere: când oxigenul este prezent, acesta intră în coliziune cu moleculele de colorant excitat şi transferă neradiativ energie, reducând intensitatea fluorescenţei şi provocând o schimbare a lungimii de undă.
4. Detecţie: lumina emisă se întoarce printr-o fibră optică la un fotodetector, unde este măsurată schimbarea de fază.
5. Calcul: sistemul calculează concentraţia de oxigen utilizând constante de calibrare derivate din relaţia Stern-Volmer.

Acest ciclu permite măsurarea în timp real a concentraţiei de oxigenului, fără consum, cu o sensibilitate remarcabilă – de la niveluri de ordinul părţilor per milion (ppm) până la concentraţii procentuale .

Există două tehnici principale utilizate pentru cuantificarea fluorescenţei stinse: detecţia bazată pe intensitate şi detecţia duratei de viaţă sau pe deplasarea de fază.

• Detecţia bazată pe intensitate: la primii senzori optici de oxigen, scăderea intensităţii fluorescenţei în raport cu o referinţă era utilizată pentru a deduce concentraţia de oxigen. Totuşi, această metodă este relativ sensibilă la variaţiile sursei de lumină, îmbătrânirea colorantului şi alinierea optică.
• Detecţia bazată pe durata de viaţă sau pe deplasarea de fază: senzorii moderni de stingere a fluorescenţei utilizează surse de lumină modulate în fază pentru a măsura întârzierea (deplasarea de fază) între lumina de excitaţie şi fluorescenţa emisă. Deoarece durata de viaţă a fluorescenţei este o proprietate moleculară intrinsecă, această metodă este mult mai puţin influenţată de condiţiile de mediu sau de variaţiile intensităţii luminii.

Durata de viaţă a fluorescenţei scade, de obicei, de la microsecunde la nanosecunde pe măsură ce concentraţia de oxigen creşte. Această abordare bazată pe fază permite timpi de răspuns rapizi, stabilitate pe termen lung şi imunitate ridicată la derivă – avantaje cheie în aplicaţiile industriale.

Fluorescenţa stinsă este, în esenţă, un proces de transfer de energie prin coliziuni între fluorofori excitaţi şi moleculele stingătorului. În cazul stingerii oxigenului, această interacţiune este guvernată de cinetica difuziei şi de suprapunerea orbitalilor moleculari.

Eficienţa stingerii depinde de factori precum:

• Rata de difuzie a oxigenului prin matricea senzorului
• Temperatura (care afectează difuzia şi frecvenţa coliziunilor)
• Vâscozitatea şi structura materialului gazdă
• Durata de viaţă în stare excitată a fluoroforului

Prin ajustarea compoziţiei şi porozităţii peliculei polimerice, inginerii pot controla rata de difuzie a oxigenului şi pot optimiza timpul de răspuns şi sensibilitatea senzorului.

Un senzor de oxigen cu fluorescenţă stinsă tipic este alcătuit din trei componente principale:

• Stratul senzorului fluorescent (matricea colorantului): o peliculă de polimer solid sau sol-gel dopată cu un colorant sensibil la oxigen (de exemplu, un complex de ruteniu sau platină); colorantul este ales pentru fotostabilitatea şi caracteristicile sale specifice de stingere
• Fibra optică sau fereastra optică: transportă lumina de excitaţie de la sursă către vârful senzorului şi transmite fluorescenţa emisă înapoi către detector; utilizarea fibrelor optice permite detecţii neinvazive şi de la distanţă
• Modulul de detecţie şi electronic: conţine sursa de lumină, fotodioda sau fotomultiplicatorul şi sistemele electronice de procesare a semnalului pentru a determina variaţiile de fază sau intensitate

Aceste componente sunt adesea integrate într-un design robust al senzorului, adecvat utilizării industriale în .conducte de gaze de proces, sonde de mediu sau bioreactoare, principiul fundamental de măsurare rămânând însă neschimbat.

Adoptarea sistemelor bazate pe fluorescenţă stinsă în măsurătorile industriale este determinată de simplitatea lor optică şi de robusteţea chimică în comparaţie cu tehnologiile convenţionale. Fluorescenţa stinsă prezintă mai multe avantaje:

• Selectivitate pentru oxigen: fluorescenţa stinsă este selectivă faţă de oxigen, cu o sensibilitate încrucişată neglijabilă la vapori de apă, hidrogen sulfurat sau dioxid de carbon – specii care interferează frecvent cu senzorii electrochimici.
• Măsurarea concentraţiilor de ordinul părţilor per milion (ppm)
• Stabilitate pe termen lung: sistemele optice nu conţin reactivi sau electroliţi consumabili. Datorită matricelor stabile ale coloranţilor şi componentelor în stare solidă, intervalele de calibrare sunt lungi, iar necesarul de întreţinere este minim.
• Măsurare rapidă şi continuă: deoarece stingerea este un proces colizional instantaneu, senzorii de fluorescenţă răspund în milisecunde la variaţiile concentraţiei de oxigen. Acest lucru permite monitorizarea în timp real a proceselor dinamice.
• Siguranţă şi compatibilitate: deoarece aceşti senzori funcţionează optic şi fără contactul eşantionului cu elemente reactive, ei pot măsura în siguranţă oxigenul în fluxuri de hidrocarburi, gaze inflamabile sau medii biologice, fără risc de aprindere sau contaminare.

Pentru analiza oxigenului sunt utilizate mai multe tehnologii, fiecare cu avantaje şi limitări specifice. Compararea acestora oferă un context util pentru situaţiile în care fluorescenţa stinsă aduce cea mai mare valoare.

• Principiul de funcţionare: detecţia optică a stingerii colizionale a colorantului excitat
• Intervalul specific: ppm – %
• Avantaje: metodă rapidă, selectivă, fără consum de reactivi, derivă redusă
• Limitări: cost iniţial relativ mai mare al senzorului

• Principiul de funcţionare: măsoară presiunea parţială a oxigenului prin reacţie electrochimică într-un electrolit solid din zirconiu la temperaturi ridicate
• Intervalul specific: %
• Avantaje: precizie mare la temperaturi ridicate; rezistenţă la medii industriale dificile
• Limitări: necesită un element de încălzire; răspuns mai lent la temperaturi scăzute; limitare la intervalul %

• Principiul de funcţionare: reacţia chimică dintre oxigen şi electrozi într-un electrolit produce un curent
• Intervalul specific: ppm – %
• Avantaje: cost redus, sisteme electronice simple
• Limitări: necesită înlocuirea periodică a celulei; sensibilitate la H₂S şi umiditate

• Principiul de funcţionare: oxigenul este atras de un câmp magnetic; se măsoară cuplul magnetic
• Intervalul specific: %
• Avantaje: precizie pentru concentraţii ridicate
• Limitări: nu este o metodă adecvată pentru fluxuri de H₂S sau hidrocarburi; limitare la intervalul %

• Principiul de funcţionare: separarea şi detecţia oxigenului prin gaz purtător şi coloană
• Intervalul specific: ppm – %
• Avantaje: precizie analitică ridicată
• Limitări: ritm lent (minute per eşantion), întreţinere ridicată

• Principiul de funcţionare: laser cu diodă reglabilă la o lungime de undă specifică la care oxigenul absoarbe lumina
• Intervalul specific: %
• Avantaje: măsurare optică fără contact; poate fi utilizată pentru măsurători in situ sau extractive
• Limitări: poate prezenta interferenţe cu alte gaze de fond; praful şi aerosolii se pot depune pe oglinzi şi geamuri

În comparaţie cu alte metode de măsurare a concentraţiei de oxigen, fluorescenţa stinsă oferă o combinaţie unică de viteză, stabilitate şi rezistenţă în medii agresive din punct de vedere chimic sau bogate în umiditate.

Difuzia oxigenului prin stratul senzorului şi durata de viaţă a fluorescenţei colorantului depind de temperatură. Prin urmare, majoritatea sistemelor includ compensarea automată a temperaturii, utilizând adesea un termistor amplasat în acelaşi loc. Compensarea presiunii poate fi, de asemenea, necesară pentru măsurătorile în fază gazoasă.

De-a lungul anilor de funcţionare, filmele senzorului pot suferi o decolorare treptată a colorantului sau murdărirea suprafeţei. Cu toate acestea, datorită materialelor moderne, duratele de viaţă ale senzorilor de peste trei până la cinci ani sunt frecvent întâlnite.

Calibrarea implică de obicei expunerea senzorului la concentraţii cunoscute de oxigen (de exemplu, azot pentru punctul zero şi aer pentru punctul de calibrare superioară). Datorită stabilităţii lor ridicate, senzorii bazaţi pe fluorescenţă necesită recalibrări mult mai rare comparativ cu alternativele electrochimice.

Noi matrici de senzori – cum ar fi hibrizii sol-gel, nanoparticulele de siliciu şi polimerii fluoruraţi – extind domeniul de funcţionare şi toleranţa la mediu a senzorilor de stingere a fluorescenţei. Aceste materiale îmbunătăţesc stabilitatea colorantului şi reduc fenomenul de fotooxidare.

Progresele recente în reţelele de fibră optică şi în fotonica miniaturizată permit realizarea de senzori multiparametrici, care combină măsurarea oxigenului, a pH-ului şi a temperaturii într-o singură sondă.

În cercetarea biologică şi microfluidică, microscopia de imagistică bazată pe durata de viaţă a fluorescenţei (FLIM) utilizează aceleaşi principii pentru a produce hărţi spaţiale ale oxigenului la scară microscopică, detectând gradientele critice pentru comportamentul celular şi procesele metabolice.

• Prelucrarea gazelor naturale– pătrunderea oxigenului în fluxurile de gaze naturale poate provoca coroziune, poate genera amestecuri explozive şi poate reduce calitatea produsului. Senzorii optici bazaţi pe fluorescenţă asigură măsurarea continuă şi precisă a oxigenului de la colectare până la distribuţie, ajutând operatorii să menţină integritatea sistemului.
• Tranziţia energetică – în aplicaţiile de captare, utilizare şi stocare a carbonului (CCUS), oxigenul este un contaminant care trebuie eliminat. biogaz/biometan se bazează pe fermentaţia anaerobă, astfel încât oxigenul trebuie monitorizat pentru a detecta eventualele scurgeri în digestor. Calitatea finală a biometanului trebuie să aibă, de asemenea, concentraţii scăzute de oxigen de ordinul ppm. Aplicaţiile de hidrogen verde necesită, la rândul lor, măsurători riguroase ale oxigenului.
• Bioprocesare şi fermentare- În biotehnologie, controlul oxigenului dizolvat este esenţial pentru metabolismul celular. Senzorii de fluorescenţă sunt utilizaţi pe scară largă în fermentatoare pentru a evita deriva şi problemele de sterilizare asociate sondelor electrochimice.
• Monitorizarea mediului şi apei – stingerea fluorescenţei măsoară oxigenul dizolvat (OD) în apele naturale şi în apele uzate. Aceşti senzori oferă durabilitate ridicată şi necesar redus de întreţinere în aplicaţii pe termen lung.
• Medicină şi ştiinţele vieţii – de la oxigenarea ţesuturilor la sistemele microfluidice, senzorii de fluorescenţă permit maparea optică, neinvazivă a oxigenului în volume mici, esenţială pentru studiile fiziologice şi farmacologice.
• Aplicaţii aerospaţiale şi energetice – fiind imune la interferenţele electromagnetice, sistemele de fluorescenţă stinsă bazate pe fibră optică sunt utilizate în testarea aerospaţială, cercetarea combustiei şi monitorizarea celulelor de carburant, unde precizia şi viteza de răspuns sunt importante.

1. Berlman, I. B. Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules (Manualul spectrelor de fluorescenţă ale moleculelor aromatice), ediţia a 2-a, Science Direct.
2. Demtröder, W. Laser Spectroscopy: Basic Concepts and Instrumentation (Spectroscopia laser: concepte de bază şi instrumentaţie), ediţia a 2-a, Springer.
3. Endress+Hauser. TDLAS and SF analyzers technology guide (Ghid privind tehnologia analizoareloer TDLAS şi FS).
4. Fluorescence Quenching (Ghid tehnologic pentru analizatoarele TDLAS şi SF. Stingerea fluorescenţei). ScienceDirect, Elsevier.
5. Lakowicz, J. R. Quenching of Fluorescence. Principles of Fluorescence Spectroscopy (Stingerea fluorescenţei. Principiile spectroscopiei fluorescenţei), ediţia a 3-a, 2006, Springer.
6. Lakowicz, J. R., et al. The Centenary of the Stern–Volmer Equation of Fluorescence Quenching (Centenarul ecuaţiei Stern-Volmer privind stingerea fluorescenţei). Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews, vol. 40, 2019, ScienceDirect.
7. Stokes Shift. IUPAC Compendium of Chemical Terminology (Gold Book) [Deplasarea Stokes. Compendiu IUPAC de terminologie chimică (Cartea de aur)], Uniunea Internaţională pentru Chimie Pură şi Aplicată.
8. The Stokes Shift (Deplasarea Stokes). Chemistry LibreTexts, Providence College.
9. Valeur, B. & Berberan-Santos, M. N. Molecular Fluorescence: Principles and Applications (Fluorescenţa moleculară: principii şi aplicaţii), ediţia a 2-a, Wiley-VCH.